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高纯质粒小量提取试剂盒(5~15mL)图片
产品货号:
WH0035
中文名称:
高纯质粒小量提取试剂盒(5~15mL)
英文名称:
HighPure Mini Plasmid DNA Kit(5-15mL)
产品规格:
50次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞,通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司新型材料,可高效、专一吸附DNA,另外由于增加了过滤柱,可去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。以下操作步骤适用于提取5~15mL过夜培养的大肠杆菌,质粒提取得率和质量与宿主菌的种类和培养条件,细胞的裂解,质粒拷贝数,质粒的稳定性,抗生素等因素有关。

本试剂盒提取的质粒DNA可适用于转染多种细胞及各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、连接等实验。

产品特点:
  • 高纯度:提取的质粒DNA可直接用于转染等高要求实验。
  • 快速:步骤少,操作简单,节省时间。
  • 高效:可提取菌体85%以上质粒DNA。


质粒得率:
质粒类型处理量得率质粒
高拷贝质粒5~15mL15~70μgpTZ,pUC,pBS,pTG-T
低拷贝质粒5~15mL5~25μgpBR322,pACYC及其衍生载体
pSC101及其衍生载体,
SuperCos,pWE15


产品组成:
组分50T
平衡液BL30mL
溶液P130mL
溶液P230mL
溶液P340mL
去蛋白液PD30mL
漂洗液PW15mL
洗脱缓冲液TB15mL
RNaseA(10mg/ml)300μL
过滤柱CS50个
吸附柱CP450个
收集管(2mL)100个


保存条件:
该试剂盒置于室温(15~25℃)干燥条件下,可保存12个月,更长时间的保存可置于2~8℃。2~8℃保存条件下,若溶液产生沉淀,使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间,必要时可在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀。第一次使用前将RNase A加入溶液P1中,混匀后置于2~8℃保存,可稳定保存12个月以上。单独包装的RNase A在室温可稳定保存12个月以上。

注意事项:(请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项)
  • 溶液P1在使用前先加入RNaseA(将试剂盒中提供的RNase A全部加入),混匀,置于2~8℃保存。
  • 使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊,如有浑浊现象,可在37℃水浴中加热几分钟,即可恢复澄清。
  • 注意不要直接接触溶液P2和P3,使用后应立即盖紧盖子。
  • 所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心,速度为12000rpm (~13400×g)。
  • 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加P1、P2、P3的用量,洗脱缓冲液应在65~70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间,以增加提取效率。
  • 实验前使用平衡液BL处理吸附柱,可以最大限度激活硅基质膜,提高得率。
  • 用平衡液BL处理过的柱子最好当天使用,放置时间过长会影响效果。


使用方法:
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶上的标签。

  • 柱平衡步骤:向吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL,12000rpm(~13400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)
  • 取5~15mL过夜培养的菌液加入离心管中,12000rpm (~13400×g)离心1min,尽量吸除上清。
    注意:菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中,菌体量以能够充分裂解为佳,过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。
  • 向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1 (请先检查是否已加入RNase A),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
    注意:请务必彻底悬浮细菌沉淀,如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
  • 向离心管中加入500μL溶液P2,温和地上下翻转6~8次使菌体充分裂解。
    注意:温和地混合,不要剧烈震荡,以免打断基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠,所用时间不应超过5min,以免质粒受到破坏。如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。
  • 向离心管中加入700μL溶液P3,立即温和地上下翻转6~8次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm (~13400×g)离心10min,此时在离心管底部形成沉淀。
    注意:P3加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。
  • 将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS(过滤柱放入收集管中),12000rpm(~13400×g)离心2min,小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中),(如果过滤柱中有残余的液体说明步骤5吸取的上清中杂质过多,可以延长离心的时间;如果离心后收集管底部有少量的沉淀,尽量地吸取上清)。
  • 12000rpm (~13400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP4放入收集管中。
  • 向吸附柱CP4中加入500μL去蛋白液PD,12000rpm (~13400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP4放入收集管中。
  • 向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm(~13400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP4放入收集管中。
    注意:加入漂洗液PW后,如果室温静置2~5min,有助于更好地去除杂质。
  • 重复操作步骤9。
  • 将吸附柱CP4重新放回收集管中置于12000rpm (~13400×g)离心2min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
    注意:漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱CP4开盖,置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  • 将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加100~300μL洗脱缓冲液TB,室温放置2min,12000rpm (~13400×g)离心1min将质粒溶液收集到离心管中。
    注意:洗脱缓冲液体积不应少于100μL,体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解,洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液,应保证其pH值在7.0~8.5范围内,pH值低于7.0会降低洗脱效率。为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2min,12000rpm(~13400×g)离心2min,将质粒溶液收集到离心管中。


质粒DNA浓度及纯度检测:
  • 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为单一条带,也可能为2到3条DNA条带,这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
  • OD260/OD280比值应为1.7~1.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用ddH2O,比值会偏低,但并不表示纯度低,因为pH值和离子存在会影响光吸收值。

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